Спектральный анализ кортексина

Выдержка из диссертации Е.А. Мельниковой «Применение эндоназального электрофореза кортексина при синдроме хронической усталости.

 

2. Методы исследования и лечения

2.1. Экспериментальные исследования

Для разработки методики эндоназального электрофореза кортексина предварительно были проведены экспериментальные исследования по определению устойчивости препарата к действию постоянного тока, выбору полярности, оптимальной концентрации и экспозиции воздействия. Хроматографическая характеристика препарата кортексина и изменение его хроматографических свойств под действием гальванизации и электрофореза проводилась ст.н.с.к.х.н. Безруковым М.В. в биохимических лабораториях НЦПЗ РАМН и ФГУ НИИ ФХМ МЗ РФ.

Аналитическую хроматографию первой партии кортексина (2007 года выпуска) проводили на хроматографе   Aglient 2000, с детекцией  при  хроматографии компонентов смеси при помощи ультрафиолетового детектора при длине волны 220 нм, а также с использованием флуоресцентного детектора, по  флуоресценции разделяемых компонентов смеси (длина волны возбуждения  220 нм, длина волны испускания 380 нм). Хроматографию проводили на колонке диаметром 4,6 мм и длиной 15см, с обращенной фазой   Ultasphere ODS 5мкм ( Beckman Coulter), и вводом в колонку 10 мкл образца с концентрацией кортексина  3,7 мг/ мл в виде водного раствора. В качестве подвижной фазы использовали градиент ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной  кислоте. Элюирование компонентов смеси с колонки производили со скоростью элюции 0.8 мл/ мин. В качестве буфера А использовали водный раствор 0,1% трифторуксусной  кислоты, а в качестве буфера  В, 70%  ацетонитрила в воде 0,1% трифторуксусной  кислотой. При флоуресцентном  детектировании на хроматограмме были определены пики веществ, со временем удержания 18-23 мин., в середине хроматограммы, и в конце хроматограммы со временем удерживания 31-34 мин. Указанные аналогичные пики веществ имеются и на хроматограмме с детекцией веществ при помощи ультрафиолетового детектора  при 220 нм и по-видимому, могут быть исходя из их гидрофобности и спектральных характеристик  триптофансодержащими пептидами, которые часто обладают биологической активностью по отношению к нервным клеткам. Гидрофильные компоненты кортексина элюируются в начале хроматограммы и детектируются при 220 нм. (Рис.2)

Исследование стабильности кортексина при электрофорезе и проникновения его через слизистую оболочку носа проводили на партии кортексина 2009 года выпуска с использованием более короткой колонки, диаметром 4,6 мм и длиной 4,5см, с сорбентом  Ultrasphere ODS 5мкм (Beckman-Coulter). При исследовании партии кортексина  использовался хроматограф Beckman-Coulter (USA), включающий в себя компьютер, насос высокого давления 128Р, ультрафиолетовый детектор 166, инжектор рейодайн 7752i с петлей для ввода проб на 20мкл. Элюирование проводили в фосфатном буфере, при этом положение пиков веществ, поглощающих при 220нм,  и внешний вид исходного хроматографического разделения был аналогичен хроматограмме первой партии (Рис.1,2). Меньшая интенсивность пиков при хроматографии второй партии была обусловлена тем, что на колонку наносилось меньшее количество кортексина, чем в первом эксперименте. Для проведения экспериментов,  10мг кортексина растворяли в 10мл воды, образцы после проведения экспериментов наносили на колонку в объеме 20мкл., что значительно меньше чем в эксперименте проведенном с первой партией  образца кортексина. Элюирование нанесенного на колонку образца проводили возрастающим градиентом ацетонитрила в воде в присутствии 0,1моль/литр дигидрофосфата калия с pH 4, со скоростью элюции 1мл/мин. Для хроматографии использовался в качестве буфера А- раствор с 0,1моль/литр дигидрофосфата калия подкисленный фосфорной кислотой до pH 4, а в качестве буфера В-70% ацетонитрил содержащий 0,11моль/литр дигидрофосфата калия подкисленный фосфорной кислотой до pH 4. Разделение кортексина проводилось в линейном градиенте с повышением концентрации ацетонитрила со скоростью элюции 1мл/мин., от 0 до 95% буфера В за 12 минут, с 12 по 16 минуту изократически в 95% буфера В, с 16 по 21 минуту проводилась промывка хроматографической колонки буфером А для переуравновешивания  и проведения последующего  эксперимента. При проведении хроматографического разделения была показана идентичность профилей элюции исходного раствора кортексина и раствора кортексина, который нанесли на турунды из ваты и через который пропускали электрический ток, т.е. подвергался гальванизации  (Рис.3,4). Небольшое уменьшение концентраций ряда пиков обусловлено процессом электродиффузии, никаких лишних пиков на хроматограмме образца кортексина, который подвергался электролизу не наблюдается, что свидетельствует о его стабильности в условиях гальванизации. При проведении  лечебной процедуры  через  турунды  смоченные раствором кортексина и введенные в нос, через которые пропускался постоянный электрический ток, было выявлено следующее. Пик со временем удерживания 9,0 мин., и составлявший в исходной смеси 2% от общего поглощения исчезает в образце кортексина после проведения электрофореза (Рис.4), по видимому за счет электродиффузии составляющих его веществ через слизистую оболочку носа, затем передвигаясь периневрально и проникая через ГЭБ. Интенсивность пика со временем удерживания 9,017 минут также уменьшается с 2,45% до 0,79. Указанные пики веществ находятся в середине хроматограммы в области удерживания соединений обладающих вышеупомянутым спектром флуоресценции. Химические соединения, присутствующие в указанных пиках,  могут содержать остатки триптофана и проявлять физиологическую  активность при переносе их при помощи электрофореза через слизистую оболочку носа и ГЭБ. Уменьшение интенсивности поглощения прочих компонентов образца кортексина происходит в меньшей степени. Интенсивность пиков полярных гидрофильных соединений слабо удерживающихся на обращенной фазе со временем удерживания 0,5 и 1мин возрастает, по видимому за счет загрязнения образца бактериальными полисахаридами или гидрофильными соединениями слизистой оболочки носа.

Таким образом, на основе данных ВЭЖХ, физико-химических свойств спектральных компонентов фракций кортексина, можно утверждать, что под действием постоянного электрического тока происходит электрофортическое диффундирование  и часть веществ из препарата кортексина поступает в кровь.